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    共聚焦成像——如何讓細胞在玻璃底培養(yǎng)皿更好地貼壁

    2016-05-11 14:57:11  來源：
    很多童學做共聚焦成像的時候都會遇到細胞貼壁難的問題。今天分享下如何處理玻璃底培養(yǎng)皿、如何選擇玻璃底培養(yǎng)皿，讓細胞妥妥地貼壁，大家做共聚焦時候能夠更得心應手。
     
       市面上常見的玻璃底培養(yǎng)皿，通常是在塑料培養(yǎng)皿底部打個洞，再將厚度為170-220μm的蓋玻片或細胞爬片用無影膠水或硅膠粘于培養(yǎng)皿底部。并不是整個培養(yǎng)皿的底部都是玻璃材質(zhì)的。適用于觀測的區(qū)域僅僅在打孔的區(qū)域。但是由于玻璃的疏水性，往往在培養(yǎng)細胞的時候，細胞不能在玻璃上很好地貼壁，生長狀態(tài)并不好，甚至在做共聚焦掃描成像的時候發(fā)生細胞脫片的現(xiàn)象。

                                             圖1  市面常見玻璃底培養(yǎng)皿
     
        想要細胞好好貼壁，所使用的玻璃底培養(yǎng)皿進行細胞培養(yǎng)之前，要確認已經(jīng)包被了特定的蛋白試劑。
     
    自己動手包被
         培養(yǎng)不同的細胞，需要的包被試劑也不同。同時，因為用于包被的蛋白是生物產(chǎn)物，所以不同公司的包被蛋白的產(chǎn)品純度和用量都是不同的，本技術(shù)帖只是提供參考，具體的包被試劑用量還是要參考所用品牌的說明書。并且*好以自己所用的試劑先做一個梯度實驗，找出*適合的包被濃度。
     
         這里以 Poly-L-Lysine 為例（PLL，sigma，P4832, 100μg/ml）：
     
       PLL包被適用于絕大多數(shù)細胞，尤其適用于中樞系統(tǒng)神經(jīng)元的培養(yǎng)。在使用時需要使單位面積上的蛋白含量（μg/cm2）達到理想的量。本例中PLL推薦包被的用量為 2μg/cm2。需要根據(jù)包被面積，包被體積，來計算所需要蛋白質(zhì)的量。
        比如：35mm玻璃底培養(yǎng)皿，細胞生長面積是3.5cm2，包被面積是4.1cm2，包被液體積是400μl，那根據(jù)推薦用量2μg/cm2。那么單孔中需要8.2μg的PLL，如果只加入400μl的PLL溶液，那PLL的溶液濃度為20.5μg/ml（約為 20μg/ml）。所以，需要用超純水將原液進行稀釋。
     
    具體步驟：
    1. 使用超純水按照1:5稀釋PLL原液。
    2. 在每個35mm玻璃底培養(yǎng)皿中加入400μl的PLL稀釋液。
    3. 室溫孵育1-2小時，吸出PLL稀釋液。
    4. 使用2ml PBS溶液或無血清培養(yǎng)基小心的清洗3次，吸盡清洗液。
    5. 直接加入細胞懸液進行培養(yǎng)。
     
    方法評價
        由于各種包被蛋白的性質(zhì)不同，不同的包被蛋白使用方法也不一樣。經(jīng)常由于需要對玻璃底培養(yǎng)皿包被，而產(chǎn)生了新的污染。而且污染往往是開始養(yǎng)細胞了以后才會發(fā)現(xiàn)，這樣不僅耽誤了時間，而且也浪費了試劑盒耗材。畢竟包被蛋白試劑和質(zhì)量有保證的玻璃底培養(yǎng)皿價格也是不菲的（質(zhì)量不過關(guān)的玻璃底培養(yǎng)皿有可能會因為膠水沒有粘勻而漏液或者使用的膠水對細胞有毒性）。
     
    無需包被的共聚焦培養(yǎng)皿
          對于想節(jié)省時間和功夫的童鞋，還是直接使用無需包被的共聚焦培養(yǎng)皿更為方便些。
         選擇合適的培養(yǎng)皿需要考慮的因素有：是否適合自己的細胞貼壁、培養(yǎng)皿的光學特性是否符合共聚焦要求。
         能符合上述因素要求的培養(yǎng)皿，不局限于帶包被的玻璃底培養(yǎng)皿，事實上，大家都知道塑料培養(yǎng)皿更便宜、相對玻璃來說，也更容易讓細胞貼壁。這里以德國ibidi的共聚焦培養(yǎng)皿為例，說一下符合共聚焦實驗的培養(yǎng)皿需要具備哪些參數(shù)：
     

                      圖2  德國ibidi共聚焦培養(yǎng)皿和高質(zhì)量玻璃底培養(yǎng)皿的底部參數(shù)對比
     
          可以看出，符合直接使用要求的共聚焦培養(yǎng)皿，它們的物理參數(shù)都是非常接近玻璃的，但同時，它們又還具有親水的特性，能讓大多數(shù)細胞更好貼壁；而且透氣性和延展性都要比玻璃更好。比如這里舉例的ibidi培養(yǎng)皿，就可讓絕大多數(shù)細胞系和原代細胞直接貼壁生長，而且不易碎，算是不錯的選擇。
       大家也可根據(jù)自己具體實驗要求，結(jié)合上述表格的參數(shù)，找到*合適自己實驗的共聚焦培養(yǎng)皿。
     
    方法評價
         選擇這類培養(yǎng)皿，不需要額外包被，大大減少了污染的風險。并且由于塑料底部比較易于加工，不需要膠水就能使其固定在培養(yǎng)皿底部。杜絕了漏液或者細胞毒性的可能。
     
    高通量共聚焦實驗耗材
      由于單個培養(yǎng)皿通量很小，如果一次要做多個樣品，操作就會比較麻煩，且試劑用量會較大，這時候可以選擇多孔的耗材，比如腔室載玻片（2/4/8孔），可以滿足研究人員需要一次進行多通量的成像。并且相對于傳統(tǒng)的共聚焦培養(yǎng)皿，腔室載玻片需要試劑的更少，非常節(jié)約價格昂貴的抗體，單孔實驗的成本大大降低。
     

                                      圖3 市面的無需包被共聚焦培養(yǎng)皿和腔室載玻片
                                             （圖片引用自德國ibidi的81156，80826）
     
          現(xiàn)在也有適用于高內(nèi)涵顯微鏡和活細胞工作站的多孔板。適合全自動成像和操作。
     

                                          圖4  市面的高內(nèi)涵顯微鏡和活細胞工作站的多孔板
    （圖片引用自德國ibidi的82406，89626；這個多孔板的壁是黑色的，可以避免成像時候孔間熒光的影響，不錯的設計。贊一個～）
     
    ＊文中圖片皆來自網(wǎng)絡，如侵權(quán)請聯(lián)系刪除。
     


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    邵瓊 女士
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